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[闲聊] CRISPR-Cas13系统抗病毒应用

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垚瑶遥 发表于 2022-7-7 16:38:41 | 只看该作者 打印 上一主题 下一主题
 
Class II Type VI CRISPR-Cas13蛋白是一类特异性靶向RNA的家族,目前已知的包括Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Cas13e、Cas13f、Cas13x和Cas13y。其中,高效性、特异性和可移植性等优点,Cas13a、Cas13b和Cas13d家族被广泛运用。Cas13家族能被用于抗病毒,尤其是RNA病毒。据统计,侵袭人类的病毒中有三分之二是单链RNA病毒,其中只有2.5%病毒的生命周期涉及DNA中间产物,因此相比于靶向DNA的Cas9和Cas12系统,Cas13系统的应用范围更广。
在2019年,Broad Institute Pardis Sabeti团队利用LwaCas13a和PspCas13b建立了CARVER(Cas13-assisted restriction of viral expression and readout)系统,不仅能抑制RNA病毒扩增,还能检测相应病毒含量[1]。PspCas13b具有5ʹ GK PFS(Protospacer adjacent motif)限制而LwaCas无限制。团队首先生信分析了396个ssRNA(single stranded RNA)病毒基因组,并证明基因组上存在大量Cas13蛋白的靶向位点,超过90%的病毒基因组上存在大于100个Cas13的靶向位点。
随后,作者挑选出LCMV、IAV和VSV这三种病毒,针对其基因组设计了多条crRNA(CRISPR RNA),利用PspCas13b和LwaCas13a蛋白切割病毒RNA,实验结果显示,Cas13系统表现出强劲的敲低效率(图1)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第1张图片

图1 PspCas13b和LwaCas13a降低病毒基因组表达

作者基于张锋开发的SHERLOCK检测平台,开发出CARVER技术:首先利用Cas13系统切割RNA病毒,随后进行HUDSON灭活、RT-RPA扩增、IVT,最终检测信号分子荧光值,判断残留病毒含量(图2E)。最终,团队利用CARVER成功检测单核苷酸多态性:当与crRNA适配的底物分子含量逐步上升时,SHERLOCK荧光值逐步上升(图2F)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第2张图片

图2 CARVER流程图

随着新冠疫情的爆发,多个团队希望利用Cas13系统对抗病毒。其中,斯坦福大学的亓磊团队和David Lewis团队率先在Cell期刊发表相应学术成果[2]。在此,研究团队基于RfxCas13d系统开发出PAC-MAN(prophylactic antiviral CRISPR in human cells)策略。团队针对SARS-CoV-2 RdRP(RNA dependent RNA polymerase)和N(Nucleocapsid)基因设计多条crRNA,利用SARS-CoV-2-GFP报告系统和qPCR检测手段证明PAC-MAN的有效性,敲低效率最高达90%(图3)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第3张图片

图3 PAC-MAN策略

随后,团队对已知的冠状病毒基因组进行分析,发现PAC-MAN打分最高的6条crRNA能够覆盖91%的冠状病毒,体现出PAC-MAN广阔的适应性(图4)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第4张图片

图4 PAC-MAN能够涵盖泛冠状病毒

2021年,墨尔本大学Sharon Lewin团队也发表了基于PspCas13b成功抑制SARS-CoV-2病毒的研究报道[3]。首先,团队针对新冠病毒Spike区域设计了多条crRNA,在HEK 293和VERO细胞系内证明PspCas13b的高效性(图5)。随后,团队利用大量的实验证明PspCas13b蛋白对crRNA部分识别区域的单碱基突变具备一定容忍度,这意味着,尽管新冠病毒能够以高频突变逃避免疫机制的识别,但却但不掉crRNA的识别。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第5张图片

图5 PspCas13b抑制SARS-CoV-2病毒

接着,团队利用最近出现的D614G突变株和野生型进行尝试。团队设计的crRNA是针对野生型的,因此并不完全匹配突变型。团队分别在病毒侵染1h、24h和48h后检测病毒滴度,实验结果表明在24和48时间点,PspCas13b能够同时识别并抑制野生型和突变体病毒株(图6e-h)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第6张图片

图6 PspCas13b识别野生型和突变体病毒

同时,在2021年,来自佐治亚理工学院和埃默里大学的Chiara Zurla和Philip Santangelo团队在细胞和小鼠模型上验证了Cas13蛋白对新冠病毒抑制作用的有效性[4]。类似的,团队先是在细胞模型上证明LbuCas13a能够抑制甲型流感IAV病毒RNA复制(图7)。在这里,团队考虑到病毒在不同生命周期内RNA定位情况不同,因此设计了具有两种不同细胞定位情况的蛋白,分别LbuCas13a和LbuCas13a-NLS。结果显示这两者皆有效。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第7张图片

图7 LbuCas13a有效性

大部分实验的流程都是先转染表达Cas13蛋白和crRNA,再用病毒侵染细胞,在不同时间点检测抗病毒效率。在此,团队则将上述流程颠倒,先侵染细胞,再表达Cas13和crRNA,实验结果依然表明Cas13能高效抑制病毒RNA,表现出其抗病毒能力的强劲性。此外,团队发现联合使用多条crRNA,发现抗病毒效力更强,这与此前的诸多报道表现出一致性。最后,该文章最大的亮点在于,团队在小鼠和仓鼠模型上进行了实验,证明LbuCas13a能在in vivo环境下发挥抗病毒功能(图8)。

CRISPR-Cas13系统抗病毒应用 第8张图片

图8 LbuCas13a在小鼠和仓鼠模型上抗病毒实验

综上所述,本文分享的4篇文章各有其侧重点。CARVER技术将LwaCas13a和PspCas13b的抗病毒能力和SHERLOCK检测能力结合,建立了end-to-end平台。PAC-MAN技术则强调RfxCas13d广阔的适应性,6条crRNA即可靶向90%的pan-coronavirus。类似的,Sharon Lewin团队发现PspCas13b crRNA具有突变位点包容性,因此能够靶向野生型和突变株病毒,进一步体现出Cas13系统的适用性。最后,Chiara Zurla和Philip Santangelo团队在小鼠和仓鼠模型上成功证明了LbuCas13a蛋白能抑制新冠病毒,突破了此前常用的细胞层面。
参考


  • ^Freije, Catherine A et al. “Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13.” Molecular cell vol. 76,5 (2019): 826-837.e11. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.013
  • ^Abbott, Timothy R et al. “Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza.” Cell vol. 181,4 (2020): 865-876.e12. doi:10.1016/j.cell.2020.04.020
  • ^Fareh, Mohamed et al. “Reprogrammed CRISPR-Cas13b suppresses SARS-CoV-2 replication and circumvents its mutational escape through mismatch tolerance.” Nature communications vol. 12,1 4270. 13 Jul. 2021, doi:10.1038/s41467-021-24577-9
  • ^Blanchard, Emmeline L et al. “Treatment of influenza and SARS-CoV-2 infections via mRNA-encoded Cas13a in rodents.” Nature biotechnology vol. 39,6 (2021): 717-726. doi:10.1038/s41587-021-00822-w



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